腫瘤的分子分型與個(gè)性化治療

上海同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化科、同濟(jì)消化疾病研究所  郜恒駿

生物芯片技術(shù)是90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的前沿、高新技術(shù)。該技術(shù)將高密度的核酸、蛋白質(zhì)、組織、細(xì)胞等包被在硅片、玻片等固相支持物上，故主要分為基因芯片、蛋白芯片、組織芯片與細(xì)胞芯片等。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜研究、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、分子標(biāo)記物篩選等，為功能基因組的研究及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具，將會(huì)在新基因的發(fā)現(xiàn)、基因診斷、藥物篩選等方面取得重大突破，為整個(gè)人類(lèi)社會(huì)健康帶來(lái)深刻而廣泛的變革。

系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）與三P醫(yī)學(xué)

過(guò)去的一百多年，腫瘤研究走進(jìn)了這樣一個(gè)誤區(qū)：腫瘤一直被認(rèn)為是一個(gè)器官的局部病變，直至今天一提到腫瘤，基礎(chǔ)與臨床研究者就會(huì)想到腫瘤細(xì)胞，對(duì)癌癥的研究也變成了癌細(xì)胞的研究。事實(shí)是腫瘤并不是一堆癌細(xì)胞的堆積，癌細(xì)胞不是孤立存在的，而是有著嚴(yán)密結(jié)構(gòu)的組織，包括間質(zhì)、血管、淋巴細(xì)胞、免疫細(xì)胞等，癌細(xì)胞的研究不等于癌癥的研究?？梢?jiàn)，對(duì)癌癥的研究也變成了癌細(xì)胞的研究顯然不妥。隨著基因組、功能基因組等各種組學(xué)的深入研究與高通量生物芯片、高通量RNAi等技術(shù)的迅猛發(fā)展以及能分析海量生物信息數(shù)據(jù)的高性能計(jì)算機(jī)問(wèn)世，系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）應(yīng)運(yùn)而生。最新研究成果不斷提示：腫瘤的發(fā)生除腫瘤細(xì)胞自身存在眾多的基因表達(dá)改變外，它更是一個(gè)全身性疾病的局部反應(yīng)，是機(jī)體作為一個(gè)生物系統(tǒng)的整體平衡失調(diào)的結(jié)果，即腫瘤是一個(gè)系統(tǒng)性疾病。其特征是局部細(xì)胞的不正常生長(zhǎng)，但這是以全身改變?yōu)楸尘暗?。這是一個(gè)非常重要的問(wèn)題：因?yàn)殚L(zhǎng)期以來(lái), 腫瘤診治未能取得突破的很重要原因是我們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)出現(xiàn)了問(wèn)題，如果舊的觀(guān)念仍然不改變，在很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，腫瘤治療將很難達(dá)到根治。希望國(guó)內(nèi)有更多從事腫瘤臨床研究的醫(yī)生能夠一起反思并重視這個(gè)問(wèn)題。系統(tǒng)生物學(xué)使得疾病的預(yù)測(cè)（Prediction）、預(yù)防（Prevention）或干預(yù)（Preemptive）、分子分型與個(gè)性化治療（Personalized therapy）即所謂的三P醫(yī)學(xué)以及分子水平早期診斷、預(yù)后評(píng)估等走到前臺(tái)，具有重大的基礎(chǔ)與臨床研究?jī)r(jià)值。

個(gè)性化治療（Personalized therapy）

臨床上，對(duì)于不同個(gè)體（如均為成年人），患同樣疾病，醫(yī)生們常常給予他們同樣治療方案、藥物、甚至劑量，事實(shí)上，其中有些患者對(duì)藥物反應(yīng)好、有些效果一般、另有一些甚至出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（ADR）?？梢?jiàn)，即使患同樣疾病，一種治療方案、藥物及其劑量并不適合所有患者?；蚪M、HapMap（SNP）與拷貝數(shù)變異（CNV）、功能基因組及其技術(shù)（如高通量生物芯片）快速發(fā)展與應(yīng)用，使得我們清楚的認(rèn)識(shí)到人與人之間存在的差異（可能達(dá)10-15%），正因?yàn)檫@些差異導(dǎo)致了人與人之間的千差萬(wàn)別，包括對(duì)疾病的不同易感性（即不同的患病風(fēng)險(xiǎn)）、對(duì)藥物的不同反應(yīng)（即不同的療效與副作用）以及疾病的不同預(yù)后。這提示我們?cè)谂R床上，對(duì)于不同個(gè)體（如均為成年人），即使患同樣疾病，醫(yī)生們應(yīng)考慮給予他們不同樣治療方案、藥物或劑量，即所謂的個(gè)性化治療。

藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics）與營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)（Nutrigenomics）

近年來(lái)，腫瘤的診治取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但在不同病人間存在著顯著的療效和毒副作用的差異。除了環(huán)境等因素外，不同個(gè)體的基因組差異是造成療效和毒副作用差異的主要因素。惡性腫瘤治療方法的發(fā)展將很大程度取決于藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics）的研究與應(yīng)用。所謂藥物基因組學(xué)是研究遺傳因素對(duì)病人藥物效應(yīng)的影響，鑒定與藥物療效和毒性相關(guān)的基因改變或基因表達(dá)譜、單核苷酸多態(tài)性（SNP）或CNV，其最終目標(biāo)是根據(jù)患者的遺傳特征（即分子分型，Molecular  Classification）建立最優(yōu)化的治療方案與最合適的劑量，獲得最高的療效，而毒副作用卻最小，使得“量體裁藥”成為現(xiàn)實(shí)。藥物基因組學(xué)將為我們從消化道腫瘤綜合治療由目前傳統(tǒng)治療模式過(guò)度到個(gè)性化指明了方向。此外，對(duì)腫瘤的防治更為超前的是個(gè)性化飲食（Personalized diet）預(yù)防或干預(yù)，即前NIH（國(guó)家健康研究所）主任Bernadine Healy博士所描述的：根據(jù)一個(gè)人出生后的基因型來(lái)確定她應(yīng)該吃什么樣食物，即所謂的營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)（Nutrigenomics）。

   分子分型（Molecular  Classification）的方法與種類(lèi)

   分子分型的方法與種類(lèi)常見(jiàn)的歸納如下。DNA水平：檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）或拷貝數(shù)變異(CNV)、DAN甲基化（DAN Methylation / Epigenomics），DNA序列分析（DNA Sequence），比較基因組雜交（CGH）、DNA芯片等；RNA水平：基因表達(dá)譜（Gene Expression Profiling，EGP）分析、MicroRNA，RNAi等；組織水平：基于組織或組織芯片（Tissue Microarray，TMA）的分子病理學(xué)。其他還有蛋白、抗體檢測(cè)或蛋白芯片方法。目前熱門(mén)的治療領(lǐng)域還有分子靶向治療（Molecular Targeted Therapy，MTT）。

    分子分型與個(gè)性化治療

幾種質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)由肝臟中CYP2C19所代謝。CYP2C19的基因型分為三種：homEM（homozygous extensive   metabolizer)，hetEM (heterozygous extensive metabolizer)和PM（poor metabolizer). 在這三種基因型中PPIs 的pharmacokinetics與pharmacodynamics均不同，治療時(shí)血漿PPI與胃內(nèi)pH 水平homEM組最低，而PM組最高。CYP2C19 的不同基因型影響基于PPIs 的療效，如GERD、PU以及H.pylori根除治療。CYP2C19基因型檢測(cè)有助于個(gè)性化指導(dǎo)確定PPI以及 PPI為基礎(chǔ)的治療方案與治療劑量。

    對(duì)27種經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)的藥物研究發(fā)現(xiàn)：其中59%至少存在1個(gè)藥物代謝酶的基因變異而嚴(yán)重影響藥物代謝，對(duì)照組的變異僅7-22%。基因變異影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)是產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的重要原因。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）仍是目前腸道等惡性腫瘤的基本化療藥物之一，是許多含有新藥的實(shí)驗(yàn)藥物配伍的基本成分之一。5-FU療效相關(guān)的基因檢測(cè)已被列入衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)?zāi)夸浿校?/SPAN>http://www.moh.gov.cn/newshtml/19264.htm）。二氫嘧啶脫氫酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD）多態(tài)性較高，已鑒定遺傳變異有39多個(gè)。中國(guó)人中，最常見(jiàn)的缺陷等位基因是DPYD*9，頻率為5-14％。該等位基因編碼的DPD酶活性完全缺失，無(wú)法代謝5-FU，使用5-FU 時(shí)毒副作用會(huì)較大，甚至危及生命。5-FdUMP能與胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthase，TS）結(jié)合，影響dUMP與TS的結(jié)合。若TS表達(dá)增高，將降低5-FU 療效，進(jìn)而影響腫瘤患者5年生存率，TS高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者比低表達(dá)者生存期短。胸腺嘧啶合成酶基因（TYMS）中影響其表達(dá)的遺傳變異，是造成個(gè)體間5-FU療效差異的主要原因之一。通過(guò)檢測(cè)DPYD和TYMS等基因遺傳變異，有助于提高5-FU療效并降低毒副作用。

   服用依立替康（Irinotecan ，CPT-11）可治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胃及食道癌。治療前需要做UGT1A1基因檢測(cè)，其遺傳學(xué)檢測(cè)已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)（Marsh S.  Mol Diag Ther, 2007, 11: 79-82.）。人尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP glucuronosyltransferase 1 family， polypeptide A1，UGTIA1）能催化CPT-11的活性形式SN-38為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物SN-38G，該基因表達(dá)差異可造成個(gè)體間SN-38G生成能力的差異。UGT1A1*28包含7個(gè)TA重復(fù)序列，是UGT1A1基因最常見(jiàn)的變異型，其頻率在亞洲人中為15％。UGT1A1*28腫瘤患者體內(nèi)UGTIA1酶缺乏，在應(yīng)用CPT-11治療時(shí)，體內(nèi)SN-38聚集，引發(fā)腹瀉或嗜中性白血球減少癥。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）能催化谷胱甘肽與鉑類(lèi)藥物結(jié)合，使之失活并增加其水溶性，促使藥物外排，因此與鉑類(lèi)藥物的細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)。GSTP1基因第105位異亮氨酸殘基突變成纈氨酸殘基后，奧沙利鉑/5-FU聯(lián)合用藥的生存率顯著提高。在DNA結(jié)合物存在的情況下，X線(xiàn)交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1（x-ray repair cross-complementing group 1，XRCC1）的Arg399Gln改變了二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）結(jié)合域的特性，降低了DNA修復(fù)能力。與純合399Arg相比，攜帶399Gln患者接受奧沙利鉑/5-FU治療效果較差，生存期短。

   80%KIT酪氨酸激酶基因突變，最常見(jiàn)位點(diǎn)是外顯子11，其他外顯子9、13和17。5-7%存在PDGFRA突變，為外顯子12和18。10-15%為野生型，無(wú)突變。DNA Sequence：可以檢測(cè)GIST突變的位點(diǎn)，評(píng)估酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（Gleevec）療效，指導(dǎo)個(gè)性化治療，外顯子11突變，對(duì)甲磺酸伊馬替尼客觀(guān)反應(yīng)率70%，400mg/d，增加劑量療效無(wú)影響；外顯子9突變，對(duì)甲磺酸伊馬替尼客觀(guān)反應(yīng)率35%，800mg/d才能獲得較高反應(yīng)率。

檢測(cè)宿主遺傳易感性最重要的意義就在于研究疾病的發(fā)病機(jī)制。具體到研究H.pylori宿主遺傳易感性的意義而言，其意義則是在以下兩方面：一是機(jī)體在受到H.pylori 攻擊時(shí)開(kāi)始發(fā)生損傷，此過(guò)程中宿主遺傳易感性起到怎樣的重要作用；二是在由H.pylori誘發(fā)的慢性炎癥過(guò)程中，胃生理機(jī)制被造成長(zhǎng)期損害，而宿主遺傳易感性在其中產(chǎn)生了如何重要的影響。明確宿主遺傳易感性的另一個(gè)重要意義是能根據(jù)某些暴露因素（如微生物、化學(xué)、飲食、藥物等）來(lái)預(yù)測(cè)臨床結(jié)局。例如：通過(guò)確定宿主遺傳易感性，對(duì)那些感染H.pylori后可能發(fā)生萎縮和低酸狀態(tài)者，因?yàn)橛羞z傳學(xué)篩查依據(jù)，這些個(gè)體就應(yīng)當(dāng)被列為需要提供根除H.pylori治療的對(duì)象。我們構(gòu)建了H.pylori感染宿主胃癌易感性基因聯(lián)合檢測(cè)芯片將有助了解不同的個(gè)體暴露于危險(xiǎn)因素時(shí)，其發(fā)生各種不同臨床結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，判斷胃癌高危個(gè)體和H.pylori根除對(duì)象，為胃十二指腸疾病，尤其是胃癌預(yù)測(cè)、預(yù)防、早期診斷和個(gè)性化治療提供新思路。

自荷蘭癌癥研究所首先發(fā)現(xiàn)的與淋巴結(jié)陰性乳腺癌預(yù)后相關(guān)的76個(gè)基因表達(dá)譜，使鑒別不需要系統(tǒng)治療的低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)原發(fā)性乳腺癌這一夢(mèng)想有可能在不遠(yuǎn)的將來(lái)成為現(xiàn)實(shí)。大約70%的乳腺癌患者術(shù)后并不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，也就是說(shuō)這70個(gè)左右的基因檢測(cè)，決定有70%的患者是不需要術(shù)后輔助治療的。美國(guó)FDA提準(zhǔn)了這一檢測(cè)，使得臨床利用基因表達(dá)譜檢測(cè)指導(dǎo)個(gè)性化治療、預(yù)測(cè)預(yù)后成為現(xiàn)實(shí)。通過(guò)分析文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)5-FU耐藥的胃癌和結(jié)直腸癌的全基因組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌和結(jié)直腸癌中與5-FU耐藥相關(guān)的表達(dá)譜是一致的，提示不同腫瘤對(duì)5-FU具有相同的耐藥機(jī)制。在胰腺癌方面，有研究分析了吉西他濱（gemcitabine）轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因?qū)σ认侔┘?xì)胞珠耐藥形成過(guò)程中的表達(dá)水平的改變，發(fā)現(xiàn)hENT1 x dCK/RRM1 x RRM2基因表達(dá)比率隨著吉西他濱耐藥性的獲得而逐步降低，因此這4個(gè)基因表達(dá)水平的比率與胰腺癌細(xì)胞珠獲得性吉西他濱耐藥相關(guān)，可能是胰腺癌吉西他濱療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。對(duì)吉西他濱敏感珠和耐藥珠（KLM1-R）的研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在KLM1-R中高表達(dá)，并且KLM1-R敲除HSP27后恢復(fù)了對(duì)吉西他濱的敏感性。在胰腺癌病人中，HSP27表達(dá)增高與吉西他濱較高的耐藥性相關(guān)，提示HSP27表達(dá)檢測(cè)可能用于胰腺癌吉西他濱的療效預(yù)測(cè)。但這些研究結(jié)果有待于大樣本量的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

   惡性腫瘤個(gè)體生物學(xué)行為的預(yù)測(cè)是臨床醫(yī)生的迫切需求，也是未來(lái)分子診斷病理學(xué)（Molecular Pathology）面臨的挑戰(zhàn)?；诮M織與組織芯片技術(shù)的惡性腫瘤預(yù)測(cè)病理學(xué)指導(dǎo)個(gè)性化治療、預(yù)測(cè)預(yù)后成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。上海芯超生物承擔(dān)了國(guó)家發(fā)改委生物芯片上海國(guó)家工程研究中心以及十五國(guó)家863《功能基因組與生物芯片》——組織生物樣本庫(kù)與組織芯片的重大項(xiàng)目。2年來(lái)，應(yīng)用自主開(kāi)發(fā)的芯超高通量組織芯片進(jìn)行腫瘤預(yù)測(cè)等分子病理學(xué)研究發(fā)表的論著近50篇，其中有國(guó)際著名雜志《Journal of Clinical Oncology》（IF15.484）2篇、《Hepatology》（IF:10.7）5篇、《Cancer Res》（IF:7.672) 1篇、《Clinical Cancer Res》（IF:6.25）1篇、《Oncologist》 (IF: 4.876）1篇、《Cancer》（IF:4.632）2篇、《Autophagy》（IF:4.657）1篇、《J Cancer Res Clin Oncol》（IF:2.366）2篇等，影響因子已經(jīng)超過(guò)100分。標(biāo)志著芯超高通量組織芯片已經(jīng)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，奠定了中國(guó)組織芯片國(guó)際品牌的地位。應(yīng)用肝癌組織芯片的合作研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝所致的肝癌術(shù)后，P48基因表達(dá)的檢測(cè)是決定術(shù)后是否應(yīng)用INF-a治療的重要標(biāo)記物。TILs、Tregs對(duì)術(shù)后肝癌預(yù)后評(píng)估及個(gè)性化治療措施的制定均有重要的指導(dǎo)作用。癌周組織中MCSF的高表達(dá)與肝癌術(shù)后預(yù)后不良密切相關(guān)。CK16與伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)。

   分子分型與分子靶向治療

   腫瘤發(fā)生、發(fā)展與一些重要的信號(hào)傳導(dǎo)（Signal transduction）通路與血管生成（Angiogenesis）密切相關(guān)。抑制或阻斷這些重要的靶點(diǎn)，能有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體及其配體在消化道惡性腫瘤常常表達(dá)增高，導(dǎo)致有絲分裂信號(hào)通路異常地活化，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控。這些受體的抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑均能阻斷這些信號(hào)通路。分子靶向治療的類(lèi)型與常用藥物：一種是抗EGFR藥物(EGFR抑制劑:EGFRI)如Gefitinib(吉非替尼，易瑞沙Iressa)、Erlotinib（埃（厄）羅替尼—小分子單抗）、Cetuximab（西妥昔單抗，IMC-C225——大分子單抗）與Nimotuzumab（尼妥珠單抗，泰欣生——人源化抗EGFR大分子單抗 ）等。cetuximab是EGFR的單克隆抗體，與化療或放療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用,具有毒副作用少、靶向性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于消化道惡性腫瘤的治療。近年來(lái)的研究顯示，KRAS突變顯著影響結(jié)直腸癌患者cetuximab療效，KRAS突變者表現(xiàn)為對(duì)cetuximab耐藥，生存期較差。因此，結(jié)合皮膚反應(yīng)和KRAS突變，可以確認(rèn)出預(yù)后較差的結(jié)直腸癌患者。另一種是抗血管生成藥物如Bevacizumab（貝伐單抗，Avastin——選擇性的抑制VEGF）、Endostar（恩度，重組人血管內(nèi)皮抑素）與Thalidomide（沙利度胺，反應(yīng)停）等。多靶點(diǎn)抑制如Sorafinib（索拉非尼，名多吉美），抑制Raf/MEK/ERK與VEGFR、PDGFR，Raf酶等多靶點(diǎn)抑制劑索拉非尼對(duì)晚期肝癌效果明顯，開(kāi)創(chuàng)了HCC分子靶向治療新時(shí)代。當(dāng)前，高通量RNAi技術(shù)的問(wèn)世，可根據(jù)自己的研究思路與研究設(shè)計(jì)，一次性地同時(shí)干擾數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)基因，這一高通量基因功能的研究工具，將在診斷標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)的篩選中發(fā)揮極其重要的作用。

   分子分型與個(gè)性化治療基礎(chǔ)研究值得重視的問(wèn)題

   臨床專(zhuān)家必要認(rèn)真思考如何開(kāi)展分子分型與個(gè)性化治療的研究。首先，課題設(shè)計(jì)很重要，當(dāng)今信息化、系統(tǒng)生物學(xué)研究時(shí)代，需要臨床專(zhuān)家、技術(shù)專(zhuān)家、基礎(chǔ)研究專(zhuān)家，甚至生物信息專(zhuān)家共同設(shè)計(jì)課題。接下來(lái)至關(guān)重要的是樣本準(zhǔn)備很重要，根據(jù)分子分型與個(gè)性化治療的研究需要，制訂標(biāo)準(zhǔn)化流程（SOP），并嚴(yán)格按照此SOP收集治療前后的組織、血清、血漿、全血等樣本以及相關(guān)重要的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與臨床資料，這是研究至關(guān)重要的環(huán)節(jié)與源頭，只有這樣研究才能有廣度與深度，結(jié)果才能具有重大的科學(xué)與應(yīng)用價(jià)值，最終應(yīng)用分子分型結(jié)果指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療。至于藥物基因組等研究技術(shù)，建議臨床醫(yī)院等研究單位應(yīng)善于整合國(guó)家級(jí)生物芯片的研究中心，作為自己的共享平臺(tái)，為我所用。最后值得重視的問(wèn)題是，藥物基因組學(xué)與生物芯片研究結(jié)果的分析需要臨床專(zhuān)家與生物信息專(zhuān)家共同完成，科學(xué)地分析并從海量信息中挖掘有價(jià)值的數(shù)據(jù)是艱巨、但是更為重要的工作。